报告的数据。本实验是非随机的。实验期间的调查研究人员不是盲配的，但在数据分析和解释期间是双盲的。没有采用统计方法来预定样本的大小。

人的血管组织。颈动脉内膜剥脱样本。本研究使用了182例人颈动脉内膜剥脱样本和无粥样硬化颈动脉。这些包括异质的动脉粥样硬化斑块样本，得自有症状进行手术的（中风或短暂性缺血性发作）或无症状的（无心血管事件史）高等级颈动脉狭窄（>50% NASCET（北美症状性颈动脉内膜切除手术试验）标准）的患者，它们已作为卡罗林斯卡动脉内膜剥脱生物库（BiKE)的一部分。15份无粥样硬化对照动脉（髂动脉和主动脉）得自没有任何心血管疾病的捐赠者。相继参与这项研究的患者，首批127例组成发现队列（40例无症状，87例有症状），以及接着的50例组成验证队列（10例无症状，40例有症状）。全部样本采自签署知情同意书的患者、器官捐赠者或他们的护人。BiKE研究得到北斯德哥尔摩伦理委员会的批准。抽提于这些样本的DNA和RNA，通过Ilumina 610w-四方微珠单核苷酸多态性芯片和Affymetrix HG-U 133 plus 2.0微阵列（发现队列），或Affymetrix

HG-U 133a基因芯片阵列（验证队列）如前所述的分析16,17，并存贮于基因表达综合数据库（登录号GSE21545）。执行强多阵列平均（RNA）标准化和处理基因表达数据回归log2数值。通过相当于转录为特定于标准化对照集的11个探针的像素强度的比较，确定每个基因的相对表达（参看http://www.affymetrix.com/support/technical/technotes/expression_comparison_

technote.pdf 和http://www.affymetrix.com/support/technical/datasheets/hgu133arrays_datasheet.

pdf)。根据Sidak-Bonferroni方法对多重比较用t检验进行校正，被用于微阵列数据的统计分析。计算皮尔逊相关系数，以确定来自微阵列的有利害关系基因和其他基因之间的关联。来自赫尔辛基颈动脉剥脱术研究（HeCES)的公开可用数据，作为第二个人实验队列31进行了分析。另外，存储于GEO（基因表达综汇）公开可用的血管和非血管微阵列数据也作了分析(如在相应图例中由GSE号码所表明的），包括采自以可用的商品TNF-α抑制剂处理的个体动脉粥样硬化斑块和样本的微解剖研究。P值<0.05被认为是具有显著性意义。

冠状动脉样本。本研究工作中，采用了共114个人冠状动脉样本。51份动脉粥样硬化心表面冠状动脉片段，如前所述，采自22个原位心脏移植捐赠者32。此外，56份冠军状动脉片段，如前所述，得自进行冠状动脉内粥样硬化斑块切除术的患者33。简言之，在血管造影诊断血流受限狭窄的动脉中，使用银雀魔爪粥样硬化斑块切除术导管，进行纵向粥样硬化斑块切除。从两组样本中分离RNA，和代表大约22000个特性定制的双染基因表达微阵列杂交32，33。简言之，从数据勘察中，鉴定了定制的探针组、动脉粥样硬化的管理、基于血管细胞培养的表达分析、以及安捷伦人1A和1B阵列的结合。在每个微阵列实验中，通过阵列特异性杂交探针组（每个转录物～10）来确定CD47的表达水平。在荧光检测期间，自动化特性抽提软件被用于滤除背景和饱和点，强烈地消除固有探针和空间的偏差。这个软件计算log2比率，和依据P值的过滤特性。这些数值遵照每个阵列的方案进行标准化，应用一个局部加权线性回归曲线拟合（LOWESS）来校正染色偏差。这个标准化程序导致阵列特异性log2比率，并了相对基因表达差异的精确测量(http://www.affymetrix.com/support/technical/datasheets/human_datasheet.pdf)。然后，来自后选转录物的标准化数据，被用于计算皮尔逊相关系数r、展现高斯分布，以及对每个相关系数计算双尾P值。

大人患者，除了把所得样本用于分析外，另加得自急性尸检的7份右冠状动脉，用连续的患病动脉进行组织学分析。这些动脉用4%多聚甲醛（PFA）固定数小时，然后，浸入30%蔗糖于4℃过夜。然后，这些粥样硬化冠状动脉和相对正常的冠状动脉片段，用石蜡或OCT（辛醇）包埋，进行连续切片，片厚7um。

为了进行免疫组化染色，石蜡切片经二甲苯和酒精梯度脱蜡和脱水，用高压蒸汽锅把原放在柠檬酸钠缓冲液（10 mM 柠檬酸钠、0.05% 吐温20、pH 6.0)中修复。这些切片用5%山羊血清阻断，然后以第一抗体（抗-CD47，Abcan B6H 12.2,2ug ml-1)或小鼠IgG1 卡帕（eBioscience,2ug ml-1)于4℃处理过夜。这些切片在PBS中洗涤，遵照制造商的说明，用MACH4试剂盒孵育，然后用Vulcan快红色素原试剂盒2（Biocare Medical)检测。平滑肌细胞（SMC）切片染色，通过在水和PBS中的洗涤来完成，接着用抗-SM22α抗体（Abcam,ab14106,1:300) 孵育。这些切片用PBS洗涤，用Alexa Fr 488 山羊抗兔（生命技术，1:250）孵育、洗涤，用Vectashield封固剂与DAPI（载体实验室）封固。用安装在倒置荧光显微镜上的尼康数码相机摄像。如上所述制备连续切片，也用马森氏三色（Richard-Allan)或苏木精和伊红（richard-Allan)染色。对冰冻切片的染色，在水中清除OCT，用油红O（ORO，Sigma-Aldrich,O0625,0.25%)，苏木精和伊红（H＆E，Richard-Allan)，平滑肌α-肌动蛋白（Abcam,ab5694,1:300),HMGB1(Abcam,ab18256,1:100),CD206(Abcam,ab64693,1:50),CD47(Abcam B6H 12.2或Novus Biologicals,#NBP2-31106,1:50)或小鼠IgG1卡帕（eBioscience)染色。第二抗体包括Alexa Flour 594山羊抗鼠（生命技术，A11005,1:300)和Alexa Flour 488山羊抗兔（生命技术，A11034，1:300)。使用同型对照和通过抗-CD47抗体与重组CD47抗原（R＆D系统）以1:5比例于应用前预孵育16小时，来证实抗体的特异性。颈动脉切片的高分辨率图像，如前所述方法获取34。

小鼠心血管组织。动脉粥样硬化模型。在动脉粥样硬化中描述如下，使用了179个雄性具有C57BL/6背景apoE缺陷小鼠（apoE-/-,Jackson实验室，商品目录#002052）。

主要动脉粥样硬化干预研究中，给8周龄小鼠皮下植入含有血管紧张素Ⅱ（AngⅡ,Sigma-Aldrich,1000ng kg-1min-1)Alzet微型泵（2004型，Alzet渗透泵），如前所述19，开始给高脂肪日粮（21%无水乳脂，19%酪蛋白和0.15%胆固醇，特殊饲料编号101511）连续4周。为了确定CD47对血管疾病的影响，给小鼠腹腔内隔日一次，如前研究的剂量注射200ug抑制抗-CD47抗体（MIAP410，BioXcell,n=18)或IgG1对照(MOPC-21,BioXcell,n=20)15。在泵植入前一天，开始抗体疗法。每天观察小鼠，对过早突然死亡的病例，进行尸检以确定死亡的原因。对精神状态正常的小鼠，于研究期间每周在基线测定一次血压（适应标准气候后，用Visitech系统公司的机器）。12周龄小鼠在饥饿一夜后处死，分离血清和内脏器官（包括主动脉）并处理分析。

慢性动脉粥样硬化研究中，断乳的雄性apoE缺陷小鼠，在4周龄开始饲喂高脂日粮，并随之维持12周（无任何血管紧张素注入）。如上所述，当给予高脂日粮时给小鼠注入抗体，并于16周龄处死（每种情况n=9)。

建立的疾病模型中，apoE缺陷小鼠在给予高脂日粮的4周龄时断乳，并继续饲喂高脂日粮8周（无任何血管紧张素注入）。12周龄时（病变形成后），开始每隔日一次给小鼠腹腔内注射200ug抗-CD47抗体（n=14）或IgG1(n=13)持续6周，于18周龄处死。

TNF-α抑制剂协同作用研究中，给8周龄apoE缺陷小鼠植入血管紧张素Ⅱ泵并维持西部高脂日粮，并将小鼠随机分成四组，包括：⑴IgG组（小鼠IgG和人Fc，n=10);⑵服用依那西普组（依那西普每kg平方每周一次0.2mg(Amgen)和小鼠IgG腹腔内隔日一次，n=8);⑶CD47抗体组（MIAP 410 50ug 腹腔内隔日一次和人Fc每平方每周一次，n=16);⑷联合组（MIAP410和依那西普，n=19)。在此模型中，抗体治疗开始于植入血管紧张素Ⅱ泵之前并连续注入AngⅡ4周，小鼠于12周龄处以安乐死。请注意，在这个模型中，抗-CD47抗体的剂量减少了75%，以确定一个较低的治疗剂量是否也可影响动脉粥样硬化的形成。

短期干预模型中，给8周龄apoE-缺陷小鼠植入AngⅡ泵，并保持高脂日粮不给予抗体治疗达23天。23天时开始，给小鼠每平方注射其中之一：⑴每天一次IgG,n=10;⑵依那西普（0.8mg/kg于23天时，n=6);⑶抗-CD47抗体（MIAP每天200ug,n=11);和⑷联合治疗，23-27天之间，n=11)。这几群小鼠于抗体治疗仅5天后（在第28天）处死，并被用于评估抗体治疗对已形成大小相同的动脉粥样硬化斑块的影响。

为了评估抗体治疗对动脉粥样硬化斑块脆弱性的影响，我们用了最近描述的"串联狭窄"模型35。在6周龄，apoE-缺陷小鼠开始饲喂高脂日粮并一直保持6周。12周龄时，如前所述，以一种方式引入了串联狭窄，显示再次产生挫折性应激并诱发了斑块的破裂。简言之，小鼠以吸入异氟烷麻醉，在右总颈动脉周围结缔组织切开一个口子。于离颈动脉杈1mm和4mm处引入一个150um外径的串联狭窄。该狭窄直径是围绕颈动脉缝6-0针缚紧使外径达150um,后来再予拆除。于手术前一天开始抗体治疗，并自此继续。手术7周后处死小鼠，经处理切片内斑块中的出血被定量。

除了用抗-CD47抗体或对照抗体处理的小鼠外，另一个单独由12只apoE缺陷雄小鼠组成的群，喂饲高脂日粮8周，或12周、或20周，不用抗体也不植入渗透微泵治疗。这些小鼠被用于确定动脉粥样硬化期间主动脉基因表达的变化，所用的RNA分析方法描述如下。在这些实验中，与喂饲标准食物日粮24周的对照C57BL/6小鼠进行了比较。

最后，一组3个apoE-/-小鼠被植入AngⅡ渗透泵和喂饲高脂日粮4周（但不用抗体处理），然后，于处死前24和6小时注射生物素标记的抗-C47抗体，以确定治疗性抗体在体内的积累。无动脉粥样硬化的C57BL/6和CD47-缺陷小鼠（CD47-/-，Jackson实验室，商品目录号#003173），也被注射生物素标记的抗体作为对照。所有小鼠按下述方法进行分析。

血管组织的制备、免疫组化和动脉粥样硬化病变的定量。如前所述，确定主动脉粥样硬化的病变区17。简言之，动脉树用PBS灌注，然后用4%多聚甲醛（PFA）固定。心脏以及主动脉-髂动脉分杈的全长被暴露，仔细地除去周围的任何组织。然后，沿着腹侧中线切开胸主动脉 ，并从鼠体解剖出来，用针固定成平面，内面向上，放在黑蜡上。主动脉图像，用安装在尼康立体显微镜上的数码相机摄取，并用Adobe Photoshop CS5软件进行分析。病变区的百分比计算，是总病变区被除以总面积。如前所述17，分析主动脉瓣区（主动脉窦）内的粥样硬化病变。样本被灌注PBS，用4%多聚甲醛固定，包埋于OCT中，并切成7um厚的切片。每个小鼠每隔100um收集4张切片，用油红O、马森氏三色、苏木精和伊红、平滑肌α-肌动蛋白（SMA，Abcan,ab5694,1:300)、Mac-3(BD科学,BD550292,1:100)、CD3(Abcam,ab5690,1:150)和Ly-6G(BD科学,BD551459,1:300)染色。动脉粥样硬化的负载，是通过斑块对内弹性膜层的比较来进行血管壁方面的定量（即定量新血管内膜中脂质的量）。如前所述，坏死核心的定量是通过计算在马森氏三色染色的非细胞部分病变区来确定的17,36。斑块的出血是按前所述37通过斑块内存在或缺乏红细胞来确定的（TER-119,Santa Cruz生物技术）。后续免疫组化研究血管腔壁方面的定量，是通过斑块对其外部弹性膜的比例来确定的（为了评估变化也涉及血管中层膜）。为了检测所注射生物素标记抗-CD47抗体的定位，应用了抗生物素蛋白-生物素复合物技术。注射生物素标记抗-CD47的小鼠主动脉窦的冰冻切片，按上述方法制备。内源性过氧化物活性，通过用0.3%过氧化氢孵育30分钟来阻断，接着切片用水和PBS洗涤，随后，用5%山羊血清阻断30分钟。每个实验方案用Vecstatin ABC试剂盒和DAB底物试剂盒检测生物素。不注射生物素抗体小鼠的相应主动脉切片被用作阴性对照，而CD47-/-小鼠如上所述地被注射。这些样本切片以免疫荧光染色，用5%山羊血清阻断30分钟，然后与链霉亲和素-Alexa Fr 546共轭（生物技术1:300）和Mac-3(BD,1:100)孵育1小时，接着与alexa Fr 488猴抗-大鼠（生命技术,1:300)孵育。每个实验方案的体内凋亡细胞，用细胞死亡检测试剂盒（罗氏），通过TUNEL阳性染色进行评估，用裂解的半胱天冬酶-3（细胞信号#9661,1:200)染色，接着通过alexa Fr 488山羊抗兔（生命技术1:250)孵育确认。测定半胱天冬酶-3阳性区，并用Adobe Photoshop定量，按照总半胱天冬酶-3阳性区被除以由油红O染色连续切片中测定的总动脉粥样硬化斑块区，计算该阳性区的百分比。为了计算活体中的吞噬指数，我们进行了裂解的半胱天冬酶-3（用Alexa Fr 488山羊抗-兔抗体检测）和Mac-3(用Alexa Fr 594山羊抗-大鼠抗体（生命技术,1:250)检测)的双重染色。不与巨噬细胞相关的游离凋亡细胞数量（由星号指明（图.2F）)由人工盲方式评估，而与巨噬细胞相关的凋亡细胞（以箭头指明）的比较按前述方法朝进行2。关于磷酸化-SHP1染色，切片用磷酸化-SHP1抗体（abcam,ab131500,1:50)和Mac-3染色，接着用Alexa Fr检测。磷酸化-SHP1阳性区对Mac-3阳性区进行标准化。所有病变区和指数，用Adobe Photoshop以盲观测定定量。如下所述，一些从组织床收集的样本在液氮中速冻，随后，进行mRNA和蛋白质表达分析。

血管组织的电子显微镜检查。如前所述17，在斯坦福大学细胞科学成像设施中进行电镜检查。简言之，样本用标准的组织学技术进行固定和处理，然后用JEOL JEM透射电镜成像。摄取凋亡体（以白色箭头指明（图.2g)）、游离凋亡体（以黄色箭头指明）和经历继发性坏死的凋亡体（以红色箭头指明），如前所述17，以盲评方式进行定性评估。

血清和血浆分析。血清化学、脂质、全血细胞计数和分化分析，如前所述17，由斯坦福动物诊断实验室进行。简言之，小鼠饥饿一夜后，采用心脏穿剌收集血样。在希森美康XT-2000ⅳ分析系统中进行自动化血液学分析。对所有全血细胞计数样本均制备血涂片，并经医学检验师审看。用西门子维度扩展分析仪进行化学分析，包括肾功能、电解质水平、肝功能检测、空腹血糖和空腹血脂类。全部检测均由同一位医学检验师执行，包括如文所指的稀释和重复测试，以审看所有的资料。血清胰岛素，根据制造商的说明（EMD Millipore)用ELISA试剂盒测定。

格里斯反应。一氧化氮合成酶的活性，使用修改过的格里斯试验评估。收集小鼠的肺样本，在PBS中均质化之前经过液氮中速冻。通过超敏比色法测定硝酸盐和亚硝酸盐的水平，遵照制造商的指示，对一氧化氮合成酶的蛋白质量标准化。

杂交小鼠多样性组。杂交小鼠多样性组（HMDP），其中包括一个109个经典的和重组近交小鼠的品系38，被用于鉴定与血管的CD47在体内表达相关的因子。简言之，如所述39，在小鼠处死时采取自弓至腹部的主动脉，快速冷冻，用RNeasy试剂盒（德国凯杰）提取总RNA。通过一雌鼠亚组104个品系与Affymetrix HT-MG_430 p.m.微阵列杂交，来确定它们的全基因组表达谱（n=每个品系2只鼠的主动脉样本）。按照制造商的指示，在一个复合的免疫捕获系统（复合鼠细胞因子/趋化因子磁珠组MCYTOMAG-70K，EMD Millipore)中进行血浆细胞因子的定量。细胞因子包括：G-CSF,GM-CSF,IFNr,IL-1α,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-6,IL-7,IL-10,IL-12(p40),IL-(p70),IL-13,IL-15,

IP-10,KC,MCP-1,MIP-1α,MIP-1β,M-CSF,MIP-2,MIG,RANTES,TNF-α。按照制造商的指示，用鼠胰岛素ELISA试剂盒（80-INSMS-E01，Alpco)测定血浆胰岛素。通过计算转录物-转录物和转录物-特性相关系数，以获得皮尔逊相关系数。使用这些方法，鉴定了这些基因和血浆细胞因子与主动脉的CD47表达水平，是显著相关的。

硅生物信息学方法。通路分析。进行全基因组相关性分析，来鉴定上述所采集人和小鼠血管组织中与CD47表达的显著性相关。这些表格，交叉地鉴定了这两个物种中跨越多个数据集常见共表达的基因。这些经过一系列生物信息学分析结果的基因表（扩展数据图.7a),包括注释、可视化和整合的发现数据库（DAVID），基因组和基因的东京百科（KEGG），基因本体论（GO）和通过进化关系分类的蛋白质分析（PANTHER）。此外，绘制初级人血管细胞中由开放染色质调节间隔的基因，以及用注释工具注释的基因集富集区（GREAT）。把发现的过度表达通路，按P值排列。应用邦费罗尼校正多个测试，进行统计学的高比例和富集分析（P<0.05显著性截取值）。

然后，使用新颖通路分析（IPA）进行人颈动脉粥样硬化（BiKE研究）和小鼠主动脉粥样硬化（HMDP研究）产生交叉的CD47共表达基因列表的分析。简言之，63个基因的标识符和表达值，在除去任何副本和未绘标识符的后，使用核心通路分析法分析。对所产生网络中的全部基因、RNAs和蛋白质，应用一个滤器除去化学物质和物后，用独创的知识数据库进行上游调节分析。用费希尔精确测试计算每个上游调节的重叠P值，通过观察比较靶基因的动向来计算激活的z-得分，以源自文献推导的调节动向来鉴定对CD47最显著的上游调节器。

启动子分析。按前述方法17，用UCSC浏览器（加州大学圣克鲁兹分校）鉴定和分析CD47启动子上游的1Kb基因序列。除评估开放的染色质状态和脱氧核糖核酸酶超敏性位点外，使用以下在线的生物信息学工具：TRANSFAC（转录因子数据库）（BIOBASE）、P-Match、TFSearch、Alibaba、PROMO和MatInspector预测潜在的转录因子结合位点（TFBS）。高可信结合位点（85%可能性截取）被进行另加的分析。此外，在对人冠状动脉初级SMCs（HCASMC）测定序列（ATAC-seq)后，推导出CD47启动子区域中与鉴定自转换可及染色质试验的开放染色质峰相交的结合位点。

细胞培养。自C57BL/6小鼠主动脉采集血管的初级SMCs，按前述方法17,40,在添加10% 胎牛血清的细胞培养液中增殖。人冠状动脉SMCs(HCASMC,Lonza目录CC-2583，传3-6代），在含有5%FBC的SmGM-2生长培养液（Lonza)中增殖。为获得人巨噬细胞，从斯坦福血液中心的匿名捐赠者得到白细胞减少系统（LRS）腔。单核细胞在一自动的MACS Pro分离器（Miltenyi)中用全血抗-CD14微珠进行纯化，通过在添加有10% AB-人血清（Gemini Bio-产品100-512）、100 U ml-1青霉素和100ug ml-1链霉素（英杰公司）的IMDM+GlutaMax(英杰公司）中培养7-10天，以分化巨噬细胞。获得的RFP+小鼠巨噬细胞，按前述方法进行评估41。简言之，分离自G57BL/Ka Rosa 26 mRFP1转基因小鼠的骨髓细胞，在添加有10% 胎牛血清、100 U ml-1青霉素、100ug ml-1链霉素和10 ng ml-1鼠M-CSF（Peprotech)的IMDM+GlutaMax中进行分化。小鼠卵黄囊内皮细胞系（C166，ATCC，CRL-2581）和鼠巨噬细胞系（RAW264.7，ATCC，TIB71）于含有10% FBS的DMEM-生长培养液中生长，而鼠T-淋巴细胞系（EL4，ATCC，TIB-39）在含有10%马血清的DMEM中生长。人巨噬细胞系（THP1，ATCC，TIB-202）在含有10% FBS和0.05mM 2-巯基乙醇的RPMI-1640培养液中生长。用于荧光素酶报告基因试验的人胚肾细胞（HEK-293，ATCC，CRL-1573）在含有10%FBS的DMEM-生长培养基中生长。没有进行额外的细胞鉴定和支原体污染检测。

施加于本实验细胞的各种与动脉粥样硬化相关的或促凋亡的剌激因子，描述如下，包括：氧化低密度脂蛋白（oxLDL,50ug ml-1,Alfa Aesar)、血管紧张素Ⅱ（100nM,Sigma-Aldrich)纤维母细胞生长因子（FGF，100ng ml-1,R＆D)、血小板源生长因子（PDGF，100ng ml-1,R＆D)和脂多糖（LPS，1ug ml-1,Sigma-Aldrich)。此外，许多与CD47表达相关的细胞因子也通过HMDP液相芯片阵列进行了测试，包括肿瘤坏死因子α（TNF-α,50ng ml-1,R＆D)，白介素2（IL-2,100ng ml-1,Biolegend),白介素4（IL-4,50ng ml-1,Biolegend),和转化生长因子β（TGF-β,50ngml-1,R＆D)。实验之前，SMCs在DMEM中血清饥饿处理24小时，然后于分析之前用上列剌激因子剌激。在一些实验中，细胞在用TNF-α处理24小时后，然后用十字孢碱（STS，1um,Sigma-Aldrich)剌激 1或4小时以诱导凋亡。

为了抑制TNF-α信号，应用了一种化学抑制剂（SPD304，Sigma-Aldrich)和一种单抗（英夫利昔单抗，Janssen）。简言之，细胞于TNF-α剌激之前，以10umM SPD304或100ugml-1英夫利昔单抗于无血清的DMEM中预孵育。为了抑制核因子-кB信号，细胞先用10uM BAY 11-7085(圣克鲁斯生物技术）或DMSO处理，然后用TNF-α剌激。

为了进行MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）免疫印迹实验，小鼠主动脉SMCs立即用血清处理48小时，以10ugml-1CD47抗体或IgG先处理20分钟，然后用血小板反应蛋白-1（TSP-1，10ugml-1,R＆D)处理10或30分钟。为进行内皮型一氧化氮合酶免疫印迹实验，C166细胞即用血清处理8小时，以2 uM TSP-1有或没有10ugml-1 CD47抗体或IgG先处理20分钟，然后用乙酰胆碱（Ach,10uM,Sigma-Aldrich)处理15分钟。

mRNA分离和定量逆转录PCR。遵照制造商的方案，用miRNeasy mini试剂盒（凯杰）分离细胞裂解产物中的RNA。用Trizol法（英杰）从小鼠器官样本中提取RNA。使用纳米微滴器（安捷伦量化技术）定量RNA。对基因转录的定量，应用MultiScribe逆转录酶（应用生物系统公司）生成cDNA,然后在ABI PRISM 7900HT上用可用的商品TaqMan引物（应用生物系统）进行扩增，并如前所述17，标准化至内部控制的18S。在扩展数据表1e中，了所应用的一系列引物和探针。

蛋白质提取和免疫印迹。如前所述17，使用添加1 ×Halt蛋白酶和磷酸酶一次性应用抑制剂混合物（Thermo科学公司）的1×细胞裂解缓冲液（细胞信号公司），从培养的细胞系和组织匀浆中分离总蛋白。每个样本中的蛋白质浓度，用皮尔斯BCA蛋白质试验试剂盒（Thermo科学公司）测定。在预制的凝胶（拉德生物公司）上分开加载等量的蛋白质，此后，把它们转移到聚偏二氟乙烯膜（拉德生物）上。接着，在制备的含有5%血清蛋白的1×TBST（洗脱缓冲液）中孵育1小时，这些膜以可用的商品抗体于4℃过夜探测，旨在识别内源性P38（细胞信号，1:1000)、磷酸P38（细胞信号，1:1000)、EPK 1/2（细胞外信号调节激酶，细胞信号,1:1000)、磷酸酶-EPK 1/2（细胞信号，1:1000)、磷酸-eNOS（细胞信号，1:1000)、 CD47(诺伟斯生物制品公司，1:1000)和GAPD（磷酸甘油醛脱氢酶，1:1000,细胞信号科技公司）。这些膜用TBST洗涤，在用SuperSignal West Pico 化学发光底物（Thermo科学）检测蛋白表达之前，与相匹配的辣根过氧化物酶-共轭抗鼠（1:5000;生命技术）或抗兔（1:5000;生命技术）抗体孵育1小时。然后，这些膜用Licor Odyssey Fc 成像仪进行定量分析。在一些实验中，负载有蛋白质的膜与预先吸附有CD47肽（R＆D系统，1866-CD，1:5稀释）的抗-CD47抗体一起孵育16小时，以测定特异性的初级抗体。

细胞凋亡试验。为了评估细胞的凋亡，根据制造商的方案，进行发光计量半胱天冬酶-球蛋白3/7试验（普洛麦格公司，G8090）。简言之，把小鼠主动脉SMCs以每孔10,000个细胞播种于96孔板在37℃生长24小时，然后血清饥饿24小时。细胞在10ugml-1抗-CD47抗体存在的情况下，用1uM STS(十字孢碱）处理4小时，诱导细胞的凋亡。通过流式细胞术进行验证试验，此处的细胞暴露于50ngml-1 TNF-α或 50ugml-1oxLDL媒介物24或72小时，然后，在胰酶替代物（TrypLE)中收集之前用1uM STS处理4小时。这些细胞用以异硫氰荧光素（FITC）和碘化丙啶（e生物科学）标记的抗膜联蛋白V抗体染色，并如前述42，用Scaford细胞分析仪（斯坦福共享设施）进行分析。这些流式细胞仪数据，通过FlowJo 10.r5进行分析。

扩增试验。采用改良的MTT（3-[4,5-二甲基-噻唑-2-yl]-2,5-二苯基四唑溴化物）分析SMC的增殖和生活力。把小鼠主动脉SMCs以每孔6000个细胞的密度播种于96孔板，在37℃生长过夜，然后，血清饥饿48小时。这些细胞以10%血清或10ugml-1 TSP1(血小板反应蛋白1）有或无10ugml-1 抗-CD47抗体或IgG剌激24小时，然后，在有10ul MTT AB溶液（Millipore)存在的情况下孵育4小时。通过添加100ul 酸性异丙醇（0.04 N Hcl)使甲腊溶解，通过SpectraMax 微孔板阅读器（分子设备）在ELISA板阅读器上以570 nm(参考波长630nm)测定吸光度。

胞葬作用试验。如前述41，进行了标准的吞噬作用试验。遵照制造商方案（英杰公司），用2.5 uM羧基荧光素琥珀酰亚胺脂（CFSE）标记SMCs。96孔板（康宁）中每孔放入10万个SMCs，于孵育前用抗体（IgG1同型对照（MOPC-21）或MIAP410（抗CD47））在37℃处理30分钟。一个无关的抗-CD8抗体，也进行了测试，作为阴性对照。30分钟后，每孔加入5万巨噬细胞，在无血清的培养液孵育2小时，然后用LSRFortessa细胞分析仪以高通量取样器（BD生物科学）取样分析。RFP+小鼠的巨噬细胞由内荧光进行鉴别。死亡细胞通过用DAPI（Sigma)染色，从分析中排除。使用细胞流量仪FlowJo X100.7r2 (树星），以GFP+巨噬细胞的百分比来评估吞噬作用，以及对每个独立捐献者抗每个细胞系的最大反应标准化。除了测定基础的胞葬率，还用先前已被各种化合物（单独或联合）包括STS、oxLDL、TNF-α、TSP1和英夫利昔单抗已处理过的靶细胞，作了重复实验。用RAW巨噬细胞进行验证性试验，此实验的靶细胞用1uM细胞追踪器深红染料（生命技术），而吞噬细胞则用细胞追踪器橙色CMRA（生命技术）于37℃标记30分钟。如上所述，这些试验中的细胞先用50ugml-1oxLDL、50ngml-1 TNF-α、或100ugml-1英夫利昔单抗处理24小时，然后在无血清培养液中与10ugml-1的IgG1同型对照抗体（MOPC-21）或抗-CD47（MIAP410）抗体在37℃共培养2小时。如前所述17，双阳性细胞用施康福细胞分析仪（斯坦福大学共享设备）进行定量，和用FlowJo 10.1r5分析。统计学的显著性用Prism5(Graphpad)以邦弗罗尼修正进行单向或双向方差分析来确定。

流式细胞仪。为了测定CD47的细胞表面表达，把细胞暴露于媒介物或50ngml-1TNF-α24小时。在一些实验中，于分析之前，细胞在孵育的最后1或4小时内用1uM STS处理。细胞被收集在TrypLE(生命科学），用抗-CD47抗体（ (AbD Serotec MCA2514GA, clone1/1A4, 1:400)或IgG(e生物科学）染色，接着用Alexa Fr 488山羊抗-小鼠（生命技术，1:400）处理，然后于1小时内用流式细胞仪(BD FACSCaliber, 530 nm 荧光 [FL1] 和>575nm

[FL3])分类。用FloJo 7.6.3.进行分析。

免疫细胞化学。把初级小鼠主动脉SMCs播种于培养皿（MatTek公司），大约60%汇聚于皿的底部。接着如上述，用TNF-α和/或STS处理，用PBS洗涤细胞，用新鲜制备的4%PFA（多聚甲醛）（费舍尔科学）固定。细胞以0.1%聚乙二醇X-100（Sigma)透化处理一次，与阻断缓冲液（3%牛血清白蛋白，细胞信号技术公司）孵育1小时，然后在4℃用CD47抗体（1:80;R＆D系统，Cat#AF1866-SP)孵育过夜。用PBS冲洗后，细胞在黑暗中用驴抗山羊Alexa Fr 594共轭第二抗体（1:1000;生命技术）孵育1小时，然后与DAPI短暂地孵育。用徕卡DMI3000B显微镜进行CD47和DAPI的定位并摄取荧光图像。还用初级人冠脉SMCs进行了上述研究，不过应用的是5%山羊血清阻断缓冲液（赛默费希尔科学公司），接着用初级和二级抗体：CD47抗体（诺伟司生物制品公司,1:50)；HMGB1（艾碧康生物,ab18256 1:100)；Alexa Fr 594山羊抗小鼠（生命技术A11005,1:300)；和Alexa Fr 488山羊抗兔（生命技术A11034)。如前述，在一些研究中，于应用CD47抗体之前，用外源性CD47肽与细胞预孵育。

荧光素酶报告基因试验。从SwitchGear基因组学和把脂质转染胺2000（英杰公司）转染进HEK细胞得到了CD47 LightSwitch启动子报告基因GoClone(RenSp,S710450)、空启动子载体（S790005）和Cypridina TK对照构件（pTK-Cluc,SN0322S)。为进行超表达试验，从Addgene质粒库获取了Nfkb1(p50)、Rela(p65)、Nfkb2(p52) 和 c-Rel表达质粒（分别为#21965、#21966、#23289、#27256）。把#21966经Hind lll酶消化而生成空载pCMV4，自生命技术公司获得了pcDNA3.1。50ng质粒用45ng RenSP报告基因和5ng pTK-Cluc报告基因构件共转染。培养基被改为新鲜的DMEM，在收集前的2、8、24和36小时添加50ngml-1TNF-α。转染48小时以后，收集细胞溶解产物和上清液，以LightSwitch双重检测系统用SpectraMax L光度计（分子设备），按制造商的说明测定双荧光素酶活性。相对的荧光素酶活性（Renilla/Cypridina荧光素酶比率），通过与未经TNF-α处理的对照-转染细胞基础值相比较的百分比变化而被定量。

染色质免疫沉淀。染色质免疫沉淀（CHIP），根据稍作修改的Millipore Magna-CHIP方案进行。人冠状动脉平滑肌细胞（HCASMC），在常规的生长培养基中培养至大约有75%的细胞汇集。细胞于1%甲醛中固定10分钟，以使染色质交联，随之在室温下与甘氨酸淬火5分钟。每个状态收集2×107细胞，并根据制造商的方案制备核溶解产物。交联的染色质核提取物用非接触式超声波破碎仪（Diagenode) 进行了3分钟的3个循环（开启30秒，关闭30秒），剪切为大约500bp的片段。剪切下来的染色质在4℃离心澄清10分钟。每个状况，用1×106胞核与2ug兔IgG或抗-NF-кBp105/p50抗体（Abcam,Ab7971)加蛋白A/G磁珠，在4℃于转台上孵育过夜，以捕获蛋白质复合物。复合物在低盐、高盐、氯化锂和TE缓冲液中洗涤，然后用含有蛋白酶K的CHIP洗脱缓冲液洗脱。随后，游离DNA用多个旋转柱纯化。总富集物用根据CD47启动子内的顶部NfkB结合位点的序列设计的引物进行测定：向前(-804～-781):5ATAGGGAAGAGCAGAGCAGAGCGAGTAGA-3和逆向（+627～+609):5GCGTGGACCAGGACACCTA-3,和负义控制区用以下引物：向前：５-CCGGAAGCACTTCTCCTAGA-3和逆向：５-AAGAGAGAGCGGAAGTGACG-3。用ＳＹＢＲ绿（应用生物系统公司）试验进行定量实时PCR(ⅶA7,生命技术公司），通过测定△△Ct-△△CtIgG来计算富集物。对每个ChIP引物，还进行了解链曲线分析。了输入DNA的百分比和用与对照IgG相关的NF-кB抗体沉淀的染色质富集物的数据。一些实验中，细胞在分离核溶解产物前２４小时，用TNF-α处理９０分钟。

统计分析。除了微阵列数据（如上所述），所有实验数据以平均数±标准误（SEM）方式。数据经过柯尔莫洛夫-斯米尔诺夫检验，以确定分布。对各组的非参数数据，用曼恩-惠特尼U检验进行比较，或对参数性数据用双尾T检验进行比较。当对多个组进行比较时，数据用一维方差分析作方差分析，随后用图基或邓尼特事后检验分析。参数性数据的多重检验，P<0.05被认为具有统计学显著性意义。体外实验至少重复3次，所有的分析均在不明对象的方式下由两个不同研究者进行，另有说明的除外。体内的干预研究，对以抗-CD47抗体和IgG处理的小鼠之间进行了比较。体内的协同研究中，如前述，对多重比较和跨越四个组的线性趋势的后续检验，进行了方差分析。体外研究中，对干预（抗-CD47抗体）和对照（IgG）物之间进行了比较。对仅用于一个附加实验（例如TNF、oxLDL、英夫利昔单抗的"载体对照"作了研究。基于TaqMan的CD47表达实验，证明了与基线状况（设置为‘1’）比较的mRNA的折叠改变的变化。在基于微阵列的实验中，于几种状况下（例如，动脉粥样硬化对非动脉粥样硬化）显示出了相对的表达差异。体外吞噬作用试验中，如前所述41，胞葬率以最大的百分比显示。采用GraphPad Prism 5 进行统计分析。除了人斑块微阵列研究（以图基箱型图显示）和相关平面图（最优拟合线表示95%的置信区间），全部误差线表示平均数的标准误。

研究的批准。全部动物研究均得到斯坦福大学实验动物保健管理小组的批准（方案批准号27279），并遵照由美国国立卫生研究院发布的"实验动物保健和应用指南"进行（NIH出版号85-23，1996年修订版）。进行全部人类的研究，均获得了受试人所写的知情同意书，并得到北斯德哥尔摩（BiKE)伦理委员会的批准。

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